Sebagian besar kolesterol dalam darah berada dalam bentuk ester kolesterol. Dalam protokol uji kolesterol, ester tersebut dihidrolisis menjadi kolesterol oleh kolesterol esterase. Kolesterol kemudian dioksidasi oleh kolesterol oksidase untuk menghasilkan H2O2 yang bereaksi dengan sonda kolesterol yang sensitif untuk menghasilkan warna (λmax = 570 nm) dan fluoresensi (Ex/Em = 535/587 nm).

Uji ini mendeteksi kolesterol total (kolesterol dan ester kolesterol) ketika kolesterol esterase disertakan dalam reaksi, atau kolesterol bebas ketika tidak disertakan. Jumlah ester kolesterol dapat ditentukan dengan mengurangkan nilai kolesterol bebas dari total (kolesterol ditambah ester kolesterol).

Ringkasan protokol uji kolesterol:

- Tambahkan sampel dan standar ke sumuran
- Tambahkan campuran reaksi kolesterol total (dengan esterase) atau campuran reaksi kolesterol bebas (tanpa esterase) dan inkubasi selama 60 menit pada suhu 37ºC
- Analisis dengan pembaca mikroplat